通過酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA) 準(zhǔn)確檢測血清或血漿樣品中的干擾素 (IFN) 會受到血清或血漿中成分（如異嗜性抗體和凝血因子）的干擾。來自這些不同成分的干擾被稱為基質(zhì)效應(yīng)。在這種情況下，為了評估 ELISA 試劑盒的性能，將已知濃度的 IFN 添加到無 IFN 的血漿中，并確定 ELISA 檢測到的濃度與實(shí)際量之間的百分比差異。這被稱為尖峰恢復(fù)。在這項(xiàng)研究中，我們描述了使用在不同抗凝劑中純混合血漿中制備的參考標(biāo)準(zhǔn)曲線的相容性研究。本技術(shù)說明中還報告了我們使用不同批次的人血漿對人 IFN α 加標(biāo)回收的結(jié)果。
介紹
ELISA 測定基于靶分子（分析物/抗原）與特異性識別靶標(biāo)的抗體的結(jié)合。使用二抗酶聯(lián)抗體檢測抗原-抗體復(fù)合物的存在。通過添加產(chǎn)生可量化信號的底物獲得檢測。通過使用不同的樣品稀釋劑對已知濃度的分析物進(jìn)行系列稀釋來制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后使用曲線的非線性 4 參數(shù)擬合來計(jì)算相似稀釋劑中未知樣品的濃度。待測分析物可存在于不同的稀釋劑中，例如含血清的組織培養(yǎng)基、純血清、純血漿和鹽緩沖液。在待測分析物存在于血清或血漿中的情況下，由于血清蛋白、異嗜性抗體和/或凝血因子的存在，可能會干擾測定。這可能會導(dǎo)致檢測到誤報、漏報或高背景。在這項(xiàng)研究中，我們展示了通過使用 PBL 的 VeriKine Human Alpha 多亞型血清 ELISA 試劑盒 41110平均大于 70% 的低濃度人干擾素 (IFN) α 實(shí)際濃度，可在人血漿中檢測到。我們還表明，未發(fā)現(xiàn)低濃度 IFN 的假陽性和假陰性，并且不存在空白的高信號。此外，我們證明標(biāo)準(zhǔn)曲線 (500-12.5 pg/ml) 在樣品稀釋劑中預(yù)稀釋至 50% 的混合血漿中制備，或在樣品制備后稀釋的純混合血漿中制備 2 X 標(biāo)準(zhǔn)曲線 (1000-25 pg/ml)稀釋至 500-12.5 pg/ml 沒有顯著差異。
方法與分析
標(biāo)準(zhǔn)曲線是從 1000 pg/ml-25 pg/ml 的樣品稀釋液、3 批不同抗凝劑（檸檬酸鈉、EDTA 鈉和肝素鈉）中的正常人血漿和三批混合液中制備的。此外，在兩個不同批次的正常人血漿中制備了低 (30 pg/ml)、中 (300 pg/ml) 和高 (800 pg/ml) 加標(biāo)物。這兩個地段不是來自游泳池中使用的地段。在此之后，將 50 μl 標(biāo)準(zhǔn)品添加到產(chǎn)品41110-1中提供的板上的 50 μl 樣品稀釋液中 人干擾素α血清樣品多亞型 ELISA 試劑盒。ELISA 的其余步驟按照試劑盒方案進(jìn)行。在單獨(dú)的測定中，比較了 1000-25 pg/ml 混合人血漿的標(biāo)準(zhǔn)曲線和 500-12.5 pg/ml 50% 混合人血漿稀釋于樣品稀釋劑中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在此測定中，將混合人血漿中的 50 μl 標(biāo)準(zhǔn)品 (1000-25 pg/ml) 添加到板上的 50 μl 樣品稀釋劑中，如果是 50% 混合血漿中的標(biāo)準(zhǔn)品 (500-12.5 pg/ml)將 100 μl 直接加載到板上。每次測定完成后，在Vmax上以 450 nm 讀取板 酶標(biāo)儀（Molecular Devices Corporation，CA）。針對每條曲線繪制 Y 軸上的平均 OD @ 450nm 與 X 軸上以 pg/ml 為單位的實(shí)際濃度。使用非線性 4 參數(shù)擬合生成曲線（圖 1-5）。
基于數(shù)據(jù)點(diǎn)的曲線擬合方程和平均 OD 值，確定每個數(shù)據(jù)點(diǎn)的外推濃度（反擬合濃度）。使用 SoftMax Pro 版本 5 (Molecular Devices Corporation, CA) 分析所有數(shù)據(jù)。
圖 1-3： 樣品稀釋液中 1000-25 pg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，3 個不同批次的純血漿和使用 3 個不同批次和不同抗凝劑的純混合血漿
圖 4-5： 在樣品稀釋液中制備的 500-12.5 pg/ml 和 50% 混合血漿的標(biāo)準(zhǔn)曲線與在樣品稀釋劑中稀釋至 500-12.5 pg/ml 的純混合血漿中的 1000-25 pg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較
表 1：不同抗凝劑中人血漿中人 IFN α A2a 的加標(biāo)回收率百分比
| % 加標(biāo)回收率 |
| > 矩陣 | 30皮克/毫升 | 300皮克/毫升 | 800皮克/毫升 |
| 含檸檬酸鈉的 Lot D | 61.2% | 102.2% | 91.5% |
| 含檸檬酸鈉的 Lot E | 79.1% | 122.5% | 127.5% |
| 含有 Na-EDTA 的批次 D | 60.6% | 84.7% | 76.81% |
| 含 Na-EDTA 的 Lot E | 58.6% | 86.96% | 91.23% |
| Lot D 與肝素鈉 | 91.88% | 107.68% | 94.88% |
| Lot E 與肝素鈉 | 98.76% | 105.32% | 106.53% |
| 平均的 | 75% | 101.56% | 98.1% |
從圖 1-3 可以看出，Na-EDTA 人血漿中的信號低于 Na-Citrate 和 Na-Heparin 人血漿中的信號。這種效應(yīng)在混合血漿中也很明顯。肝素鈉血漿中的信號在三種抗凝劑中比較強(qiáng)。與樣品稀釋液中的信號相比，由于血漿中的成分，人血漿中的信號也很明顯受到抑制。從圖 4-5 中可以看出，根據(jù)平板上相應(yīng)最終濃度的 IFN Alpha 的 OD，在未稀釋的混合血漿中制備了 1000-25 pg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中添加了 50 μl 曲線無論使用何種抗凝血劑，50 μl 樣品稀釋液在平板上類似于在 50% 混合血漿中制備的 500-12.5 pg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然而，由于來自不同供體的血漿中成分的數(shù)量和差異不同，兩條曲線之間的相似程度可能因血漿批次而異。從表 1 中可以看出，低濃度加標(biāo) IFN Alpha A 2a (30 pg/ml) 的加標(biāo)回收率在含 EDTA 鈉的血漿中較小，在含肝素鈉的血漿中最高。總體而言，平均加標(biāo)回收率在可接受的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。
結(jié)論
為了準(zhǔn)確測定血漿中人干擾素α的濃度，未知血漿樣品必須在樣品稀釋液中按 1:2 稀釋。1:2 稀釋之前的所有預(yù)稀釋都應(yīng)在含有相同抗凝劑的正常人血漿中進(jìn)行。樣品的未知濃度必須從標(biāo)準(zhǔn)曲線 (1000-25 pg/ml) 中推斷出來，該標(biāo)準(zhǔn)曲線是在具有不可檢測量的內(nèi)源性 IFN α 的正常人血漿中制備的，或者是一組不含內(nèi)源性 IFN α 的血漿批次，并且 50 μl 曲線必須添加到板上的 50 μl 樣品稀釋液中。使用產(chǎn)品 41110 從人血漿中回收的加標(biāo)回收率確實(shí)因血漿批次而異。為獲得最準(zhǔn)確的結(jié)果，加標(biāo)回收率應(yīng)根據(jù)在含有相同抗凝劑的混合血漿中繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線推斷得出。產(chǎn)品性能 41110 在以 Na-Heparin 作為抗凝劑的血漿樣品中最好，在以 Na-EDTA 作為抗凝劑的血漿中最差。
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