故障排除

以下故障排除指南旨在解釋免疫細(xì)胞化學(xué)/免疫熒光 (ICC/IF) 染色中觀察到的常見問題的原因和可能的解決方案。

沒信號

抗體應(yīng)用

增加一抗或二抗的濃度或孵育時間。

透化緩沖液

• 使用適當(dāng)?shù)耐富噭┻M(jìn)行靶蛋白的定位。 Triton 去污劑對于線粒體或核蛋白是必需的，但會溶解外膜并破壞正確的膜定位。

• 增加孵育時間或洗滌劑濃度。

細(xì)胞固定

• 過度固定可能會導(dǎo)致表位掩蔽。減少固定劑的時間或濃度。

抗體相容性

• 通過檢查物種反應(yīng)性來確認(rèn)您的一抗和二抗是否兼容。

• 確認(rèn)抗體可用于蛋白質(zhì)處于天然構(gòu)象的測定。

• 通過使用陽性對照初級濾光片，確保次級濾光片正常工作并與顯微鏡的濾光片組兼容。

目標(biāo)可用性

• 使用已知表達(dá)目的蛋白的過表達(dá)測定或陽性對照細(xì)胞系。

細(xì)胞干燥

• 如果細(xì)胞干燥，熒光信號將會丟失。環(huán)蓋玻片涂有指甲油。

細(xì)胞活力

• 在開始染色程序之前確認(rèn)細(xì)胞活力。

顯微鏡調(diào)整

• 增加相機(jī)的曝光時間。

背景

抗體濃度

• 降低一抗/二抗的濃度。

阻塞

• 增加封閉緩沖液中的孵育時間或血清濃度。使用封閉緩沖液稀釋一抗和二抗。

抗體應(yīng)用

• 始終將一抗在 4° C 下孵育過夜。室溫孵育會增加非特異性結(jié)合并導(dǎo)致更高的背景。

• 通過在沒有初級的情況下進(jìn)行測定，確認(rèn)次級不會與細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)。

污染文物

• 確保載玻片清潔且無灰塵。緩沖液應(yīng)新鮮配制，以防止微生物污染。

洗滌

• 增加洗滌次數(shù)。對板進(jìn)行非常溫和的攪拌。

• 增加 PBS-T 中 Tween 的濃度。

光譜重疊

• 如果對細(xì)胞進(jìn)行雙重或三重標(biāo)記，請確認(rèn)二級細(xì)胞不會重疊到相同的光譜范圍內(nèi)