冷凍干燥是將需要干燥的藥液預(yù)先冷凍成固體的干燥方法。并在低溫低壓條件下直接升華以除去冷凍狀態(tài)的水，而不需要經(jīng)過(guò)液態(tài)。由于整個(gè)操作過(guò)程處于低溫狀態(tài)，因此該方法特別適用于熱敏性蛋白藥物制劑的制備。凍干后的蛋白藥物呈松散狀，不僅有利于保存，而且有利于蛋白藥物復(fù)溶后的復(fù)性。

顯然，凍干技術(shù)為理化性質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)藥物的制備提供了有效的方法。然而，凍干過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的相變過(guò)程。藥物在冷凍、凍融、干燥、儲(chǔ)存過(guò)程中引起蛋白質(zhì)變性的因素有很多。因此往往需要使用一些保護(hù)劑來(lái)穩(wěn)定處方中的蛋白質(zhì)。冷凍保護(hù)劑種類繁多，作用機(jī)制也復(fù)雜。本文將對(duì)蛋白質(zhì)凍干產(chǎn)品的保護(hù)劑進(jìn)行綜述。

在凍干制品的整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中，存在著多種應(yīng)力，包括低溫應(yīng)力、冷凍應(yīng)力、干燥應(yīng)力等。這些應(yīng)激往往是直接或間接導(dǎo)致蛋白藥物不穩(wěn)定的因素。根據(jù)抗應(yīng)激保護(hù)劑的不同，蛋白質(zhì)保護(hù)劑初步分為冷凍保護(hù)劑和凍干保護(hù)劑。優(yōu)秀的蛋白質(zhì)保護(hù)劑不僅可以在整個(gè)凍干過(guò)程中保護(hù)蛋白質(zhì)藥物，而且可以抑制蛋白質(zhì)藥物在成品儲(chǔ)存期間的變性。由于蛋白質(zhì)藥物在儲(chǔ)存過(guò)程中的變性速率往往大于冷凍干燥過(guò)程中的變性速率，大多數(shù)在溶液中有效的蛋白質(zhì)冷凍保護(hù)劑對(duì)干燥蛋白質(zhì)沒(méi)有保護(hù)作用，甚至?xí)铀俚鞍踪|(zhì)藥物的不穩(wěn)定比例。

為了擴(kuò)大保護(hù)作用，需要在凍干產(chǎn)品中使用兩種以上的保護(hù)劑，如多羥基化合物、糖、蛋白質(zhì)、聚合物、氨基酸、鹽、胺、表面活性劑等。

1.多羥基化合物

多羥基化合物長(zhǎng)期以來(lái)被用作蛋白質(zhì)的防凍劑。常見(jiàn)的凍干保護(hù)劑有甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇、硫醇、聚乙二醇等。甘油可以促進(jìn)凍干*酶的復(fù)性。而當(dāng)甘油濃度升至0.8%時(shí)，*酶即可全復(fù)性。在某些處方中，甘露醇可以作為蛋白質(zhì)的凍干保護(hù)劑。甘露醇對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)作用與其濃度、形態(tài)、結(jié)構(gòu)有關(guān)，其濃度有時(shí)與晶體形態(tài)有關(guān)。一般認(rèn)為，無(wú)定形甘露醇具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用，而結(jié)晶甘露醇則失去保護(hù)功能。1%或更低濃度的甘露醇通過(guò)形成無(wú)定形結(jié)構(gòu)阻止蛋白質(zhì)藥物的聚集，但高濃度的甘露醇容易形成結(jié)晶態(tài)促進(jìn)蛋白質(zhì)藥物的聚集。

2.糖

糖是最常見(jiàn)和廣泛使用的凍干保護(hù)劑類型。它是蛋白質(zhì)的非特異性穩(wěn)定劑，在凍干的各個(gè)階段都能對(duì)蛋白質(zhì)藥物起到一定的保護(hù)作用。糖的保護(hù)作用與其類型有關(guān)，蛋白質(zhì)和雙糖是研究最多也有效的保護(hù)劑，其中蔗糖是由一分子葡萄糖和一分子果糖組成的二糖，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)無(wú)定形。對(duì)于阻斷蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，冷凍干燥過(guò)程和延長(zhǎng)儲(chǔ)存期間蛋白質(zhì)的延伸和聚集發(fā)揮著重要作用。

與蔗糖相比，海藻糖的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度較高，吸濕性較低，無(wú)還原性。這些優(yōu)點(diǎn)都表明海藻糖可能具有更廣闊的應(yīng)用前景。與小分子糖相比，大分子糖似乎對(duì)蛋白質(zhì)提供的保護(hù)較少。許多研究表明，高分子量的多糖并不是凍干保護(hù)劑的選擇。

但一些研究卻顯示出相反的結(jié)果，如大分子量菊粉研究表明，聚合度為5.5-6.0的菊粉對(duì)堿性磷酸酶的保護(hù)作用明顯高于海藻糖和低聚合度的菊粉。這說(shuō)明多糖的保護(hù)作用不能一概而論。

特別是在儲(chǔ)存期間，右旋糖酐或多糖可以提高產(chǎn)品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，防止蛋白質(zhì)因產(chǎn)品崩解而被破壞。葡萄糖在凍干過(guò)程中可以部分保持無(wú)定形形式，這對(duì)某些蛋白質(zhì)藥物有一定的保護(hù)作用，但需要注意的是，應(yīng)謹(jǐn)慎選擇以葡萄糖為基礎(chǔ)的還原糖作為蛋白質(zhì)保護(hù)劑。糖對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)作用有時(shí)取決于其濃度。

通常，糖的保護(hù)作用在一定濃度范圍內(nèi)隨著濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)，保護(hù)作用達(dá)到最大值，然后增加糖的濃度，保護(hù)作用不再明顯增加，有時(shí)反而會(huì)降低。關(guān)于糖發(fā)揮最大保護(hù)作用時(shí)的濃度有不同的報(bào)道。

例如，100mmol/L蔗糖對(duì)B-半乳糖酶具有最佳保護(hù)作用，而對(duì)磷酸果糖激酶提供最大保護(hù)作用的海藻糖濃度為300mg/ml。已報(bào)道的可實(shí)現(xiàn)最大穩(wěn)定的低糖濃度是足夠的在蛋白質(zhì)表面形成單分子層。

事實(shí)上，糖對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)作用不僅取決于糖的總體濃度，還取決于兩者的比例。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)α-D-吡喃甘露糖、乳糖、海藻糖、纖維二糖與重組人生長(zhǎng)激素的摩爾比為131:1時(shí)，它們都能100%占據(jù)重組人生長(zhǎng)激素上的強(qiáng)水結(jié)合位點(diǎn)和弱水結(jié)合位點(diǎn)，提供最佳保護(hù)效果。當(dāng)摩爾比達(dá)到300:1和1000:1時(shí)，糖對(duì)重組人生長(zhǎng)激素的保護(hù)作用不再增加，并且在某些處方中保護(hù)作用會(huì)降低。

糖的還原特性和其他特性也會(huì)影響其對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)作用。葡萄糖、乳糖、麥芽糖、纖維二糖和其他還原糖可與蛋白質(zhì)中暴露的某些氨基酸殘基發(fā)生麥拉德反應(yīng)（氨或棕色反應(yīng)）。會(huì)使產(chǎn)品變黃并降低蛋白質(zhì)活性。不同旋光度的麥芽糖糊精在凍干過(guò)程中對(duì)乳酸脫氫酶的保護(hù)作用表現(xiàn)出很大差異。

目前用作蛋白質(zhì)保護(hù)劑的糖包括葡萄糖、α-D-吡喃甘露糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、纖維二糖、甘露糖、麥芽糖、肌醇、白糖、菊粉、葡聚糖、麥芽糖糊精、麥亞多糖、肝素、2-羥丙基-B環(huán)糊精和很快。雖然糖可以為大多數(shù)蛋白質(zhì)提供可靠的保護(hù)，但并不是所有的蛋白質(zhì)都能受到糖的保護(hù)，這仍需要更細(xì)致和深入的研究。

3.氨基酸

氨基酸是常見(jiàn)的蛋白質(zhì)保護(hù)劑之一。在冷凍過(guò)程中，低濃度的甘氨酸可以通過(guò)抑制10或100mmol/L磷酸緩沖鹽結(jié)晶引起的pH值變化來(lái)防止蛋白質(zhì)藥物的變性。無(wú)定形形式的甘氨酸可以防止重組人生長(zhǎng)激素在冷凍干燥過(guò)程中聚集。結(jié)晶甘氨酸可提高成品的崩解溫度，防止崩解引起的蛋白質(zhì)藥物的破壞。常用的氨基酸蛋白保護(hù)劑有脯氨酸、色氨酸、谷氨酸鈉、丙氨酸、甘氨酸、鹽酸賴氨酸、肌氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等。

4.聚合物

聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、明膠、聚乙烯亞胺和其他聚合物也常用作蛋白質(zhì)的冷凍保護(hù)劑。一般來(lái)說(shuō)，聚合物的穩(wěn)定效果取決于聚合物的多種性能。不同聚合度和濃度的聚合物提供不同的保護(hù)。例如，聚合度高的PVP具有較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。隨著PVP濃度和分子量的增加，水溶液的粘度會(huì)增加，蔗糖的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度會(huì)顯著升高，這也增加了冷凍過(guò)程中對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)。

但聚合度太大時(shí)，聚合物會(huì)在冷凍過(guò)程中結(jié)晶，失去對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)作用。過(guò)高的濃度和分子量會(huì)增加最終產(chǎn)品的水分，使產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)更加不穩(wěn)定。右旋糖酐40對(duì)豬胰蛋白酶的穩(wěn)定作用比右旋糖酐80更強(qiáng)，表明適當(dāng)?shù)木酆衔镦滈L(zhǎng)有利于胰蛋白酶的穩(wěn)定性。

5.蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)保護(hù)劑可分為兩類：一類是蛋白質(zhì)藥物，另一類是外來(lái)蛋白質(zhì)。一些蛋白質(zhì)凍融后的活性與蛋白質(zhì)的初始濃度直接相關(guān)。初始濃度的增加有時(shí)會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)的復(fù)性。

常用的外來(lái)蛋白質(zhì)保護(hù)劑是血清白蛋白，它是一種經(jīng)典且優(yōu)異的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。例如，1%牛血清白蛋白可以防止兔肌肉乳酸脫氫酶水溶液在冷凍時(shí)失去活性。人血清白蛋白在較低濃度（0.05%-0.1%）下能有效阻止蛋白質(zhì)表面的吸附，對(duì)凍干過(guò)程中對(duì)數(shù)蛋白質(zhì)有保護(hù)作用。但由于血清白蛋白潛在的血源性病原體污染限制了其在蛋白質(zhì)產(chǎn)品中的應(yīng)用。重組人白蛋白已被推薦作為血清白蛋白的替代品。

6.其他

一些表面活性劑（Tween 80、Bridger、Pluronic、十二烷磺酸鈉）可以在冷凍機(jī)干燥過(guò)程中對(duì)蛋白質(zhì)起到一定的保護(hù)作用。在一些凍干產(chǎn)品中，添加鹽和胺可以獲得特定的蛋白質(zhì)穩(wěn)定效果。不同類型的保護(hù)劑組合可以得到穩(wěn)定性更好的凍干產(chǎn)品。

如何獲得穩(wěn)定的凍干蛋白產(chǎn)品，選擇合適的保護(hù)劑非常重要。那么如何選擇合適的防護(hù)劑呢？首先我們要對(duì)所要保護(hù)的蛋白藥物的理化性質(zhì)有充分的了解，然后通過(guò)實(shí)驗(yàn)找出導(dǎo)致蛋白藥物在凍干過(guò)程和儲(chǔ)存過(guò)程中不穩(wěn)定的因素，然后針對(duì)這些不穩(wěn)定因素選擇具體的防護(hù)劑。一般來(lái)說(shuō)，糖和多羥基化合物是常用的凍干保護(hù)劑。其中，蔗糖、海藻糖等二糖對(duì)某些蛋白質(zhì)能表現(xiàn)出良好的保護(hù)作用。

優(yōu)秀的凍干保護(hù)劑應(yīng)具有多種保護(hù)性能，如高玻璃化轉(zhuǎn)變溫度、低吸濕性、低結(jié)晶率、不含還原基團(tuán)等。但任何單一的保護(hù)劑不可能具備所有的保護(hù)特性，因此有時(shí)必須考慮2種或多種保護(hù)劑來(lái)穩(wěn)定蛋白質(zhì)藥物。

結(jié)論

隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的蛋白質(zhì)藥物被開(kāi)發(fā)出來(lái)。迄今為止，除了采用冷凍干燥技術(shù)外，還沒(méi)有更有效的制備方法來(lái)制備更穩(wěn)定的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。即使采用凍干技術(shù)制備某些蛋白質(zhì)產(chǎn)品，仍然需要一些有效的輔助方法，例如添加凍干保護(hù)劑以增加蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。近年來(lái)，凍干保護(hù)劑及其保護(hù)機(jī)制的研究更加深入。尤其是蛋白質(zhì)分析方法的改進(jìn)，為蛋白質(zhì)保護(hù)劑的研究提供了便利。

計(jì)算機(jī)技術(shù)在凍干過(guò)程中的應(yīng)用，使得能夠建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型來(lái)模擬和分析物料在凍干過(guò)程中的真實(shí)狀態(tài)，這也使得凍干技術(shù)得以改進(jìn)和提高。但蛋白質(zhì)穩(wěn)定機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，蛋白質(zhì)凍干產(chǎn)品的研究有待進(jìn)一步深化。開(kāi)發(fā)更好的凍干保護(hù)劑和提高蛋白藥物凍干產(chǎn)品的質(zhì)量仍然是當(dāng)前生物技術(shù)藥物研究的重點(diǎn)和方向。