吸光度測量基礎(chǔ)知識

紫外-可見光吸光度測量長期以來一直是生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室中定量純化生物分子的標(biāo)準(zhǔn)方法。該方法允許根據(jù)分子在特定波長下的吸光度曲線快速檢測分子。

吸光度還提供樣品污染的指示。吸光度光譜的形狀將根據(jù)其他分子的存在而變化，這些分子的吸收波長與目標(biāo)分子相同或接近相同波長。

熒光定量基礎(chǔ)知識

熒光團(tuán)是吸收一個(gè)波長（激發(fā)波長）的光并發(fā)射另一個(gè)波長（發(fā)射波長）的光的分子。某些熒光團(tuán)的結(jié)構(gòu)只有在與特定分子（例如雙鏈 DNA）結(jié)合時(shí)才能發(fā)出熒光。熒光檢測利用這種結(jié)合特異性來建立樣品發(fā)射的熒光量與溶液中目標(biāo)生物分子濃度之間的直接關(guān)聯(lián)。

通過將熒光基團(tuán)與已知濃度的樣品混合并測量相對熒光單位 （RFU），可以繪制濃度與測得的 RFU 之間的關(guān)系，并將其用作標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后可以將與未知樣品結(jié)合的相同熒光團(tuán)的發(fā)射光與該標(biāo)準(zhǔn)曲線作圖，以確定樣品濃度。

比較吸光度和熒光結(jié)果

在比較基于吸光度的方法和基于熒光的方法的結(jié)果時(shí)，重要的是要考慮每種方法的特異性。例如，在 260 nm 處的吸光度測量對 dsDNA 沒有選擇性，因?yàn)?ssDNA 和 RNA 也在 260 nm 處吸收。在 260 nm 處的任何吸光度測量都是對樣品中所有核酸和存在的任何污染物（包括蛋白質(zhì)）的測量。這適用于所有類型的測量，而不僅僅是核酸。因此，吸光度法非常適合測量純樣品。

相比之下，熒光檢測對給定的分析物具有高度特異性，包括但不限于 dsDNA、ssDNA、RNA 或蛋白質(zhì)。通常，通過吸光度測量的樣品濃度大于通過熒光方法測量的濃度。