RNA-simple isolation Reagent

適用范圍:常規(guī)動(dòng)物組織(如：肝臟、心臟、腎臟、腦組織、骨骼肌等，不包括脾臟和肺臟)、植物組織(如水稻、玉米、擬南芥、煙草、小麥、大豆等，不包括棉花)、各類細(xì)胞系均具有很好的提取效果。保存條件：2-8℃提取試劑操作流程：

廣泛適用于從各類動(dòng)物組織、植物材料、培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌等 樣品中提取 Total RNA 和Small RNA。與傳統(tǒng) Trizol 一樣屬于通用型 Total RNA 提取試劑，與 傳統(tǒng) Trizol 提取方法相比，本產(chǎn)品使用方法簡單，不需要使用氯仿進(jìn)行分層，且全程可在常溫 進(jìn)行；此外，本產(chǎn)品在高效地抑制 RNA 酶(Rnase)活性的同時(shí)，將蛋白質(zhì)、DNA、多糖等雜 質(zhì)沉淀到管底，從而實(shí)現(xiàn)單相提取，并有力保證了 RNA的完整度和純度。使用本產(chǎn)品在 50min 內(nèi)即可完成全部的提取過程，提取的 RNA 可以直接用于 cDNA 克隆、qRT-PCR 檢測、mRNA 純化、體外翻譯、Northern blotting雜交、高通量測序等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

使用方法1.樣本處理1) 動(dòng)物/植物組織① 將新鮮組織經(jīng)液氮速凍后，迅速轉(zhuǎn)移至液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨，期間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀(無明顯可見顆粒)?！心ゲ蝗珪绊?RNA 的得率和質(zhì)量。② 將研磨成粉的樣品轉(zhuǎn)移至離心管中，大約每25mg組織加入500ul本試劑，劇烈振蕩或移液槍吹打，使樣品充分裂解?！?每500ul本試劑最多可以裂解50mg常規(guī)組織，過多的樣本量可能會導(dǎo)致裂解不充分，并使產(chǎn)物純度降低?！糠猪g性強(qiáng)或含較多外基質(zhì)的組織，可能會出現(xiàn)不能全溶解的現(xiàn)象，在下一步操作RNA 提取的步驟 2)中將進(jìn)入沉淀中，不會影響后續(xù) RNA 提取及 RNA 質(zhì)量?！?若沒有條件用液氮研磨，可將新鮮組織盡量剪碎浸泡在本試劑中，用電動(dòng)勻漿器高速勻漿至組織塊全裂解。2) 懸浮細(xì)胞① 離心收集細(xì)胞，將獲得的細(xì)胞沉淀用1×PBS重懸，再次離心，棄盡上清。② 加入本試劑，每1 - 5×106個(gè)細(xì)胞加入500ul本試劑。③ 用移液器反復(fù)吹打直至充分裂解。3) 貼壁細(xì)胞① 棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用1×PBS清洗一次。② 通常，每10cm直徑的細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)的細(xì)胞加入2-3ml本試劑，常規(guī)六孔板(孔直徑3.5cm)每孔加500ul本試劑，使之充分覆蓋到細(xì)胞表面，然后用移液器將細(xì)胞吹打下來?！鴮τ谫N壁牢固的細(xì)胞(細(xì)胞團(tuán))可采用細(xì)胞刮或潔凈的槍頭剝離，亦可在加入本試劑之前采用胰酶將細(xì)胞消化下來，然后按照懸浮細(xì)胞處理。③ 將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，用移液器反復(fù)吹打直至充分裂解。2.RNA提取1) 向上述裂解液中加入2/5體積的Rnase-free Water(每500ul本試劑使用200ul)，上下顛倒混勻，室溫靜置5min。2) 12,000×g 室溫離心15min。3) 取出離心管，此時(shí)溶液分成上層水相(含RNA)和深色的下層沉淀(含蛋白質(zhì)、DNA、多糖等雜質(zhì))，小心吸取上層水相至一個(gè)新的離心管中?！蠈铀嗟捏w積約占總體積的 90%，如用 500ul 本試劑進(jìn)行提取，上層水相約為 640ul，建議吸取 500ul；針對微量的樣本進(jìn)行提取時(shí)，為減少 RNA 損失，可以全部轉(zhuǎn)移上清?！?dāng)樣本的投入低于推薦量時(shí)，離心后可能不會出現(xiàn)下層沉淀，屬于正?，F(xiàn)象，可繼續(xù)按后續(xù)步驟完成提取。4) 加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜置10min。5) 12,000×g 室溫離心10min，通?？梢钥匆姲咨恋恚⌒臈壢ド锨?。▲部分組織材料由于含有較多的代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致沉淀不能聚集而分散在離心管壁上，此時(shí)，請沿液面緩慢吸取上清。6) 加入500ul 75%乙醇(Rnase-free Water配制)，輕彈管底讓沉淀懸浮起來，并上下顛倒數(shù)次。7) 8,000×g 室溫離心3min，棄去上清。8) 重復(fù)步驟6和7一遍，棄盡上清?！鵀闇p少雜質(zhì)殘留，應(yīng)盡可能的將上清棄干凈。建議棄去大部分上清后，短暫離心將殘留液體甩至管底，再用移液器將剩余液體全部吸掉。9) 室溫放置晾干，加入適量的Rnase-free Water溶解沉淀，室溫渦旋3min(或使用移液器反復(fù)吹打)，使RNA沉淀充分溶解。提取的RNA產(chǎn)物可以分裝后在-85~-65℃長期保存，在-30~ -15℃僅可短期保存?！鳵NA 沉淀晾干 2-3min 即可，不要過度晾干，RNA 全干燥后會很難溶解?！鳵NA 產(chǎn)物需要充分溶解，否則可能導(dǎo)致濃度定量失準(zhǔn)以及 OD260/OD280 比值偏低。3.產(chǎn)物檢測1) 產(chǎn)物純度可用分光光度計(jì)檢測，OD260/OD280比值在1.8-2.2之間表明RNA純度較高。2) 產(chǎn)物濃度可以采用分光光度計(jì)檢測，RNA濃度(ng/ul)=OD260×稀釋倍數(shù)×40；或者采用Qubit直接檢測。3) 取0.5- 1ug RNA，用1×TE或Rnase-free Water稀釋至8ul，再加入1ul 10×DNA loading buffer，混勻，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳；或采用2100檢測，測定RNA產(chǎn)物的RIN值。 

常見問題及解決方案 

1.RNA發(fā)生降解RNA降解可能發(fā)生在多個(gè)環(huán)節(jié)，實(shí)驗(yàn)過程中需要注意以下事項(xiàng)：① 確保提取RNA的試劑和器具沒有被Rnase污染，所有離心管、槍頭及相關(guān)溶液都必須無Rnase污染，耐高溫器物可于150℃烘烤4-6h以去除Rnase，其它器物可用0.1%DEPC水浸泡過夜；② 做好防護(hù)工作，戴口罩和一次性干凈手套，并在單獨(dú)的潔凈區(qū)操作；③ 細(xì)胞或組織樣品需立即加入本試劑，并迅速進(jìn)行勻漿裂解。若處理不當(dāng)，發(fā)生細(xì)胞或組織凍融，Rnase會被釋放出來降解RNA。針對內(nèi)源Rnase含量高或不易勻漿的組織，需將組織切成小塊后立即投入液氮冷凍，然后進(jìn)行研磨，在整個(gè)研磨過程中，樣品不得融化；④ 提取的RNA樣品需要妥善保存，建議取少量進(jìn)行檢測，其余樣品分裝于-85~-65℃保存。進(jìn)行電泳檢測可以提高電壓并縮短跑膠時(shí)間，同時(shí)對電泳緩沖液進(jìn)行冰浴降溫，防止跑膠過程中RNA發(fā)生降解。2.出現(xiàn)污染① 蛋白質(zhì)污染：采用分光光度計(jì)檢測提取產(chǎn)物OD260/OD280偏低時(shí)，提示可能存在蛋白質(zhì)污染。遇到此種情況，需要考是否組織投入量過大，導(dǎo)致裂解不充分，可以適當(dāng)增加本試劑或者降低組織投入量進(jìn)行提取；② 多糖污染：采用分光光度計(jì)檢測提取產(chǎn)物OD260/OD230偏低時(shí)，提示可能存在多糖污染，需要考慮是否是因?yàn)橐掖嘉慈コ蓛艋蛘呤墙M織投入量過大導(dǎo)致，此時(shí)，可以在RNA提取步驟9時(shí)適當(dāng)延長RNA晾干時(shí)間或適當(dāng)降低組織投入量進(jìn)行提取操作；③ 脂肪污染：處理脂肪含量豐富的組織時(shí)，經(jīng)過RNA提取步驟2之后，上層是大量脂肪，可以轉(zhuǎn)移澄清的中間層進(jìn)行下一步操作。3.加入異丙醇離心后看不見沉淀通常情況下，經(jīng)過異丙醇沉淀可以看見白色沉淀。若遇到沉淀不可見的情況，可能是RNA含量低或者組織投入量過低，建議加入異丙醇(RNA提取步驟4)后在2~8℃或-30~-15℃放置10-30min后再離心；且在RNA提取步驟5進(jìn)行棄上清操作時(shí)，請采用吸取而不是傾倒的方法，以免沉淀丟失。此外，部分組織材料由于含有較多的代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致沉淀不能聚集而分散在離心管壁上，此時(shí)，請沿液面緩慢吸取上清。4.如何保存組織樣本如果不能立刻提取 RNA，應(yīng)將組織離體后迅速投入液氮冷凍，并用液氮保存；或液氮速凍后，轉(zhuǎn)移至-85~-65℃保存。不能直接將新鮮組織放在-85~-65℃冷凍，因?yàn)闃悠返膬鼋Y(jié)是一個(gè)緩慢的過程，在這個(gè)過程中內(nèi)源 Rnase 會將 RNA 降解。

本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途

上海牧榮生物科技有限公司

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